Basic tips voor de cryopreservatie van celculturen

Basic tips voor de cryopreservatie van celculturen

Cellen blijven hun metabolisme tijdens normale groeiactiviteiten voortzetten, wat de deelname van verschillende proteasen vereist. Wanneer de temperatuur onder -70 ° C daalt, werken proteasen niet meer. Daarom kunnen cellen in een omgeving met extreem lage temperaturen hun metabole activiteiten stoppen en een slapende toestand betreden die opslag op lange termijn mogelijk maakt.

1. Experimentele materialen

Basis materiaal:

Basiscultuurmedium

Serum (conventionele FBS/NBS)

Ultrapure werkbank

Steriel dimethylsulfoxide (DMSO)

Steriele PBS fosfaatbuffer zoutoplossing

Pipetteerpistool

Elektrisch pipetterend pistool

Voorbereiding van de experimenten

a) Bereiding van de bevriezingsoplossing:

Algemene cellen: 55% basaal medium + 40% runderserum (FBS/NBS) + 5% DMSO

Vitale cellen: 90% runderserum (FBS/NBS) + 10% DMSO

Aliot de voorbereide cryopreservatieoplossing in een 15 ml centrifugebuis [nest] en bewaren bij 4 ° C voor later gebruik.

(b) Bereiding van te bevroren cellen:

Voordat u de cellen bevriest, selecteert u cellen met een goede groeimiddelen en in de logaritmische groeifase en vervangt u ze door vers medium 12-24 uur vóór het bevriezen om de celconditie te behouden.

2. Experimentele procedure

1. Observeer de dichtheid van de te bevroren cellen, wat ongeveer 80%~ 90%is. Gebruik een pipetpistool om het oude medium te aspireren, voeg steriele PBS toe om de cellen 1-2 keer te wassen en verwijder het resterende medium in de kweekomgeving.

2. Voeg een geschikte hoeveelheid trypsine of spijsverteringssap toe zodat de trypsine de cellen kan betreden en plaats ze in de incubator voor de spijsvertering. Let op de toestand van de cellen onder de microscoop: het cytoplasma trekt zich terug en de cellen zijn niet langer verbonden in vellen. Voeg op dit punt de stopoplossing toe om het spijsverteringsproces te stoppen.

3. Bubbel de cellen voorzichtig met een punt om een ​​celsuspensie te vormen en de celsuspensie te centrifugeren bij 1000 rpm gedurende 3-5 minuten.

Gooi het supernatant weg, voeg een geschikte hoeveelheid ijskoude oplossing toe en pipet voorzichtig om de cellen uniform te laten tellen. Pas de celdichtheid aan met cryopreservatiemedium aan om de uiteindelijke dichtheid 5 × 106/ml ~ 1 × 107/ml te maken.

4. Gebruik een pipetpistool om de cryogene buizen te scheiden op basis van de verwachte capaciteit en gebruik een automatische afdekmachine om te dichten en af ​​te dichten.

5. Het standaard cryopreservatieprogramma is een koelsnelheid van -1 ° C tot -2 ° C/min en de te bevroren cellen kunnen geleidelijk worden ingevroren volgens de volgende stappen: kamertemperatuur → 4 ° C (20 minuten) → - 20 ° C (30 minuten) → -80 ° C ° C (overnacht) → Langdurige opslag in vloeibare stikstof.

Het kan ook direct in een vriezer worden bewaard bij -80 ° C en vervolgens worden overgebracht naar vloeibare stikstof voor opslag.

Yongyue Medical is een hightech onderneming die gespecialiseerd is in R&D, productie en verkoop van biomedische verbruiksartikelen. Pipet -tips, pipetten, PCR -plaat, celkweekproducten en andere biologische laboratoriumverbruiksgoederen. Yongyue Medical is uw vertrouwen en keuze waard! Welkom bij Consult!